肉制品掺假鉴别与定量检测

发表日期:2017-05-04

  肉及肉制品掺假是当前世界各国普遍关注的热点问题,肉制品掺假鉴别及定量检测技术的研究日渐成为食品安全领域的研究热点。本文简述了常见肉制品掺假形式,针对成分替代这种最常见的掺假形式,综合阐述蛋白质检测、核酸检测、红外光谱及电子鼻等多种肉制品掺假鉴别检测技术,以及基于核酸定量的肉制品掺假定量检测技术,并对各种技术的优缺点进行了分析和讨论。
  自从2013年涉及欧洲l6国的“马肉风波”曝光以来,肉及肉制品掺假成为世界各国共同关注的热点问题。在国内,一些不法商贩将相对低价的马肉、猪肉、鸭肉等肉类原料掺入到牛肉、羊肉制品进行销售以谋取不当利益,从而严重侵犯消费者的合法权益。这些掺假肉制品的出现会影响消费者的身体健康和生命安全。此外,这些掺假肉制品出口到国外会严重损害食品企业形象及国家信誉。因此,近年来,我国从两个方面人手狠抓肉制品掺假,一方面是通过制定《中华人民共和国食品安全法》、《中华人民共和国农产品质量安全法》等严格的法律法规约束生产者和经营者的行为;另一方面不断开发运用更准确、有效的检测方法,为食品监管提供有力的技术保障和支撑。
 
  1、常见肉制品掺假形式
  近年来国内发生的肉类掺假事件的主要掺假方式是在高价肉及肉制品中掺人低价的肉类原料,尤其突出的是在羊肉、牛肉制品中掺假。这种掺假方式消费者普遍关注,事实上,肉制品掺假的方式涉及到肉制品生产、加工、经营的各个环节,方式五花八门。BALLIN将肉制品掺假或欺诈问题归为四类:来源欺诈、成分替代、加工过程改变及非肉类成分添加。来源欺诈具体是指肉品标注的性别、年龄、养殖方式、地理溯源及饲料摄取等与事实不符。成分替代是指将低价肉品替换或掺入高价肉品,这些低价肉品可能是低价可食用肉类,如猪肉、鸭肉掺入羊肉;也可能是非食用肉类掺假,如马肉、狐狸肉、甚至猫肉、老鼠肉掺人可食用肉中,这种掺假方式最为恶劣,消费者可能因为食用这些未经检验检疫的肉品而产生严重的健康隐患。加工过程改变可能涉及肉品新鲜与否、是否化冻等方面的欺诈。非肉类成分添加可能涉及着色剂、防腐剂、香味剂的添加,以及注水、加入大豆粉等方式。
 
  2、肉制品掺假鉴别技术
  近1O多年来,随着应用现代仪器分析与生物技术的迅猛发展,肉制品掺假鉴别技术经历了从宏观到微观、从形态识别到分子水平检测的发展历程,目前肉制品掺假鉴别形成了以蛋白质检测和以核酸检测为基础的两大主要检测体系,此外,组织学方法及红外光谱法、电子鼻等技术在肉制品掺假鉴别领域也都有应用。以蛋白质检测为基础的肉类本质鉴别技术包括免疫分析技术、蛋白质组学技术。免疫分析技术主要采用酶联免疫吸附测定法(ELISA),该方法是一种将抗原一抗体反应的高特异性与酶的高效催化作用相结合的免疫分析技术,具有高灵敏度、高通量、操作简便、快速等优点。目前用于肉类掺假的ELISA方法主要针对肌肉和血清中的特异性蛋白标志分子,MACEDO等通过制备抗马、猪、鸡、牛白蛋白抗血清,采用ELISA方法,鉴别汉堡中可能掺入的低价肉类成分。这种基于抗原一抗体反应的免疫分析方法的最大缺憾是对于亲缘关系较近的物种易出现交叉反应,从而产生假阳性结果,尽管单克隆抗体能大大提高检测特异性,但其昂贵的制备成本和繁杂的制备步骤无疑限制了其应用。近年来,蛋白质组学技术被越来越多地用于肉类真伪鉴别研究。该方法以物种或成分的特异肽段为生物标志物,常规的研究步骤包括蛋白质提取、利用聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管电泳、等电聚焦电泳等电泳技术分离、胰酶消化及最后的色谱.质谱方法对肽段的分析与鉴别。SENTANDRU等采用MALDI.TOF和LC-ESI—MS/MS鉴别猪肉中掺人的鸡肉成分,其检测灵敏度可以达到0.5%。然而,由于肉制品中蛋白质稳定性差、含量变化范围广,干扰因素多等诸多原因导致此类技术的灵敏度较低,假阳性率较高,且操作步骤繁琐、检测成本较高。
  以核酸检测为基础的肉制品掺假鉴别技术是基于DNA序列特异性的分子生物技术,以动物种属间遗传信息差异作为物种鉴别检测靶标的核酸检测方法如今被广泛应用。与蛋白质检测方法相比,DNA的热稳定性及酸碱稳定性均优于蛋白质,因此在加工后肉制品的鉴别检测中具有明显优势,而核酸检测方法的高灵敏度和特异性也是蛋白检测方法无法比拟的。DNA探针杂交是最早用于食品中肉类成分鉴别的核酸检测方法。近l0多年来,DNA扩增技术成为食品中肉类种属鉴别的核心方法,大量研究报道了基于DNA扩增的多种核酸分析方法对肉类本质进行鉴别,包括传统PCR扩增¨、多重PCR、荧光PCR¨、限制性片段长度多态性分析(RFLP)、随机扩增多态性DNA分析(RAPD)、DNA测序及基因芯片技术等。
  核酸扩增技术的关键是扩增靶标序列的特异性及灵敏度,线粒体DNA凭借其较高的种间多样性及较低的种内变异,且在细胞中拷贝数多、灵敏度高、进化速度快等优势,已被广泛应用于肉制品掺假核酸鉴别技术。细胞色素6基因、12S和16S核糖体RNA亚基及细胞色素氧化酶I基因等是常用的线粒体基因。RIPOLI等¨针对18种常见动物的细胞色素b基因设计通用引物和特异性引物进行PCR扩增,从而较好地对18种动物进行了种属鉴别。
  红外光谱技术由红外光谱仪与化学计量学相结合,已经成为一种方便、快捷、无损、高效的检测技术,近些年该技术被国内外学者广泛应用于食品种类鉴定和真伪鉴别领域。红外光谱一般分为近红外、中红外和远红外3个区段,其中近红外技术在肉制品掺假鉴别中应用最为普遍。牛晓颖等采用傅里叶变换近红外光谱分析技术对冷鲜驴肉、牛肉、羊肉和猪肉进行了鉴别研究,通过建立和优化驴肉、牛肉、猪肉和羊肉肉块及大中小三个粉碎粒径肉糜样品的近红外分类模型,比较了3种监督模式识别算法对肉类样品的分类效果,研究结果表明使用近红外光谱分析技术结合化学计量学方法鉴别驴肉准确率可以达到100%,而马氏距离判别和SIMCA方法较适合肉类样品的分类,两种方法均具有判别精度高、算法简单、运算速度快等特点。张玉华等¨采用近红外光谱结合主成分分析法(PCA)、判别分析法,分别建立了牛肉和羊肉中掺杂其它动物肉的定性鉴别模型,结果表明牛肉、羊肉中掺猪肉和鸭肉模型对训练集和预测集的鉴别准确率均达到90%以上。
  近年来电子鼻技术在食品鉴别行业中的应用也日趋增多,基于其检测快速、操作简单、重现性好等优点,电子鼻技术已成为一种有效的肉制品检测工具,在肉制品新鲜度检测、品质判定和掺假检测等方面都有应用¨。电子鼻是由气敏传感器阵列、信号处理系统和模式识别系统三大部分组成的。电子鼻通过分析肉类食品中挥发性物质,生成的信号被传送到信号处理系统进行处理和加工,最终由模式识别系统对信号处理的结果作出综合的判断。NURJULIANA等¨采用声表面波电子鼻检测了肉与肉制品是否清真,并采用顶空进样气质联用确认其中的挥发性成分。结果表明,电子鼻能够将猪肉、猪肉香肠与牛肉,鸡肉、鸡肉香肠与羊肉进行有效区分。然而,电子鼻技术仍处于不断发展的阶段,其在肉制品检测中的检测灵敏度、识别率等尚未达到令人满意的效果。
 
  3、肉制品掺假定量检测技术
  20世纪90年代,对于肉制品掺假定量检测的探索首先采用的是蛋白质分析方法。LIU等采用ELISA方法检测猪肉中的热稳定肌肉蛋白,并对原料及加热处理的肉制品中猪源性成分进行定量,其检出限达到0.05%一0.5%。MORALES等采用DD9杂交瘤细胞株针对猪肌肉蛋白构建单克隆抗体,尝试通过ELISA方法定量测定牛肉和鸡肉中掺入的猪肉成分。MARTIN等通过琼脂糖凝胶放射免疫扩散(RID)和ELISA法对牛肉馅中1%~75%的猪肉参杂进行定量,结果显示RID定量方法的检出限为3%一5%,相对标准偏差22%,回收率为105%;ELISA法的检出限达到1%,相对标准偏差18%,回收率114%。然而,由于在动物死后蛋白质稳定性迅速破坏,蛋白质分析方法在加工肉制品检测中明显受限,因此随着DNA检测方法的成熟,核酸定量方法被认为是更有效的肉制品掺假定量检测方法心。此外,JORGE等采用重复性的PCR检测方法定量检测生熟牛肉馅及肉酱中的猪肉掺假。该研究通过PCR电泳条带的光密度测定,依据光密度值与猪肉含量之间的标准曲线进行定量分析,该方法可以对加热、未加热的牛肉馅中的1%猪肉进行定量。目前,采用荧光实时定量PCR,以不同物种线粒体基因为扩增靶标基因对肉制品中的动物源性成分进行种属鉴定已发展为普遍采用的肉制品掺假检测技术。由于线粒体基因为多拷贝基因,其检测灵敏度高,可以检出0。001%的肉类掺假,灵敏度高固然是该方法的优点,但同时在区分无意识的交叉污染与有意识的非法添加时产生困扰,因此,该方法适用于肉类掺假的筛选鉴别。肉制品掺假定量不但可以鉴别低浓度的无意交叉污染与有意非法添加,而且可以明确掺假比例。而对于无意交叉污染与有意非法添加的区分。目前国内外尚无法规及标准给出具体的浓度限值。国内外文献的相关报道一般只提供某种具体方法的检出限或定量限。众所周知,实时荧光PCR技术是目前DNA定量研究的主要方法,但该技术应用于肉制品中不同组分的定量,尚存在诸多问题。首先,由于不法分子制售的伪劣肉制品可能掺人猪肉、马肉、骆驼肉、鸭肉、狗肉、鸡肉等低价肉品中的一种或多种,从而使与之相应物种的标准品的配制困难重重。其次,常用于动物源性物种鉴别的线粒体基因,在不同物种细胞中的拷贝数各不相同,因此,以线粒体为靶基因的检测结果很难定量分析出肉制品中的动物源性成分的组成比例。此外,目前通过荧光PCR定量技术和数字PCR定量技术可以获得各个物种相关基因的拷贝数,然而拷贝数绝对定量对于肉制品掺假的监管没有实际意义。
  尽管上述肉制品掺假定量检测存在现实的困难,仍有个别报道尝试采用荧光PCR定量方法进行肉制品掺假定量。胡智恺等选择扩增物种特异性单拷贝持家基因,避免不同物种间靶标基因拷贝数差异对定量结果的影响。通过核酸测定仪测定DNA浓度,计算鸡和牛的质量与DNA浓度的比值作为牛肉、鸡肉质量与DNA浓度的比值常数;通过样品基因组DNA扩增后绘制的牛源性DNA和鸡源性DNA扩增标准曲线,计算样品中所含有的相应物种的DNA含量;通过牛肉、鸡肉质量与DNA浓度的比值常数将DNA含量转化为样品质量;两个物种样品质量相比计算两个物种成分的质量百分比。编辑认为该方法实现了质量水平上的成分百分比含量分析,实验的绝对误差值可以控制在5%之内。宋丽萍等根据猪的单拷贝基因口.actin和绵羊的单拷贝基因催乳素受体所设计的特异性引物,采用相同的分析方法对猪、羊混合的纯瘦肉样本中的动物源性成分进行定量分析,实验的绝对误差值在10%之内。显而易见,核酸相对定量方法测定的是样品中某两种成分DNA拷贝数的比例关系,而对于食品监管而言,需要的是一个样品中某两种成分的质量百分比。上述两个研究以样品质量与DNA浓度的比值为常数,将DNA拷贝数比转换为质量比,忽略了样品核酸提取效率的差异对结果的影响。而核酸提取效率受诸多因素影响,如操作人员操作手法略有差异可能会造成提取效率的显著差异,混合样品中两种组分的不同混合比例可能造成不同组分核酸提取效率的差异等等。此外,该研究仅以少数几次测定结果确定样品质量与DNA浓度的比值常数,并无统计学分析结果支撑。
  SONIA等采用双重PCR半定量法测定禽肉中掺入的猪肉成分,一个PCR反应体系中同时扩增猪线粒体cytb基因和家禽特异性线粒体12SrRNA基因,琼脂糖凝胶电泳分离两条目的条带,采用图像分析App读取PCR条带的荧光强度。根据不同浓度预配参比样品的扩增结果,以猪肉成分百分含量为横坐标,以Ⅳ猪为纵坐标制作标准曲线,N猪=猪荧光强度/(猪荧光强度+禽荧光强度)。N猪一定程度消除了核酸提取、PCR扩增及电泳环节的不稳定带来的影响。其结果表明,该方法可用于定量禽肉中1%~75%的猪肉掺假,其灵敏度可以达到0.1%,多次重复测定的相对标准偏差在4.I%~7.6%之间。2014年,SONIA等采用Taqman探针荧光PCR法对汉堡、肉丸、烤肠等肉类加工品中掺入的大豆进行定量,分别扩增大豆看家基因Lectin及18SrRNA基因,18SrRNA基因是真核生物共有基因,通过18SrRNA基因扩增可以获得样品中所有源自真核生物的DNA的拷贝数,具有内参比作用,可有效消除核酸提取、PCR扩增的批次差异的影响。该方法可以对肉制品中掺入的0.01%一6%的大豆蛋白进行定量,其重复测定的相对标准偏差在4.1%一11.3%之间,满足食品定量检测要求。然而,该方法的最大问题是,由于实验室环境中无处不在的真核细胞,极易导致18SrRNA基因发生污染。
  4、结语
  针对不同的肉制品掺假形式进行掺假鉴别目前已经有多种技术手段,随着分子生物学、光谱学、化学计量学、仪器分析等技术的不断进步,肉制品掺假鉴别将在快速、低成本、高灵敏度和准确率等方面日臻完善。然而,由于肉制品成分多样、肉类加工品及熟肉制品成分的改变以及荧光PCR相对定量方法在标准品、拷贝数比与质量含量换算之间的限制等诸多因素决定了建立能准确定量、被普遍认可的肉制品掺假定量检测方法尚待时日。


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